Исследователи разработали новый метод анализа металлопротеинов только с крошечной жидкой пробой. Этот прорыв был достигнут исследовательской группой во главе с доцентом Эйдзи Омичи и Цубасой Окамото из Высшей школы науки Университета Кобе. Результаты были опубликованы 28 ноября в « Прикладной физике».

Рисунок 1: (а) Фотография наномембраны. Сама наномембрана очень тонкая (100 нм), поэтому она выглядит прозрачной для невооруженного глаза. Предмет, окруженный в центре, является крошечным магнитом для обнаружения ЭПР. (б) Фотография ячейки раствора. Контейнер покрыт тефлоновой крышкой, чтобы предотвратить испарение образца раствора. (c) Экспериментальная установка спектроскопии ЭПР с детектированием силы. Ячейка с раствором, содержащая образец для измерения, помещается над мембраной с прикрепленными магнитами. Изменения в наномембране обнаруживаются оптическим волокном под мембраной. Фото: Университет Кобе

Металлопротеины (также известные как металл-связывающие белки) играют жизненно важную роль для транспорта и хранения кислорода, транспорта электронов, окисления и восстановления. Во многих случаях ионы металлов в этих белках являются активными центрами этих действий, поэтому, идентифицируя точное состояние этих ионов, мы можем понять механизмы, лежащие в основе их функций.

Экспериментальный метод, называемый электронным парамагнитным резонансом (ЭПР), может быть использован для измерения состояния электронных ионов в белках. Эффективные методы ЭПР требуют определенного объема образца для чувствительных измерений. Однако многие металлопротеины трудно выделить и измельчить, поэтому исследователи могут получить только небольшие образцы.

Обычные измерения ЭПР обнаруживают электромагнитные волны, поглощенные ионами металлов. Примечательной особенностью этого исследования является использование устройства в форме батута, называемого наномембраной (рисунок 1 (а)). В ЭПР спин электрона переходит в высокоэнергетическое состояние, поглощая электромагнитные волны, но в то же время направление вращения меняется на противоположное, и магнитные свойства ионов металла также изменяются. Перед экспериментом исследовательская группа прикрепила к наномембране крошечные магниты, поэтому изменения силы притяжения между магнитами и ионами металла превращаются в силу на наномембране, и этот сигнал ЭПР обнаруживается. Поскольку наномембрана очень тонкая — всего 100 нм (= 0,1 мкм), мы можем чутко измерить небольшие изменения силы, которые сопровождают поглощение ЭПР.

Результаты измерений ЭПР, полученные в этом исследовании из образца замороженного раствора

Рисунок 2: Результаты измерений ЭПР, полученные в этом исследовании из образца замороженного раствора. Верхние две диаграммы для хлорида гемина, а график внизу для миоглобина. Красная линия — это проецируемый сигнал от симулятора значений. Концентрации раствора и объемы образцов составляли 50 мМ ± 2 мкл для хемина гемина и 8,8 мМ 、 10 мкл для миоглобина. Измерения проводились при 4,2 К. Изучив две линии на верхнем правом графике, мы можем определить точное состояние ионов железа. Верхний левый график показывает молекулярную структуру хемина гемина. Фото: Университет Кобе

Образец раствора помещается в ячейку с раствором непосредственно над мембраной (рис. 1 (б)). Объем ячейки составляет всего 50 мкл (= 0,05 куб. См), и команда добавляет примерно 1-10 мкл (0,001-0,01 куб. См) раствора для измерения. Чтобы предотвратить испарение раствора, ячейка закрыта крышкой из смолы. В этом методе тонкая и хрупкая наномембрана не зависит от ячейки раствора, что облегчает переключение образцов (рис. 1 (с)).

Чтобы оценить производительность этой установки, команда провела измерение EPR на высокой частоте (более 0,1 ТГц) для железосодержащего белка, называемого миоглобином, и его модельного комплекса хлорида гемина (рис. 2). Команде удалось обнаружить сигналы ЭПР на широкой частоте волны (0,1-0,35 ТГц) для концентрации 50 мМ, 2 мкл раствора хлорида гемина. Они также наблюдали характерный сигнал ЭПР для образца миоглобина объемом 8,8 мМ, 10 мкл. Большим преимуществом этого метода является возможность измерения в широком диапазоне частот, что делает его применимым для металлопротеинов с различными магнитными свойствами.

Профессор Омичи комментирует: «Этот новый метод позволяет детально определить состояние ионов металлов в крошечном количестве раствора металлопротеина. Возможно, мы сможем применить этот метод к металлопротеинам, которые ранее не могли быть измерены. Например, в нашем метаболизме металлопротеин, называемый пероксидазой, играет решающую роль, превращая перекись водорода в воду, делая ее безвредной, но детали механизма этого реактивного процесса все еще неясны. Результаты этого исследования могут потенциально применяться в качестве ведущего метода анализа, чтобы пролить свет на этот жизненно важный феномен».

По материалам phys.org